Isolation of Secondary Metabolite A. niger “In-Habiting” Queen M. gilvus Hagen.’s Nest

76

Indo. J. Phar. Scie. Tech. Vol. 5, No. 2, 61-70 (2018).

Yohannes Alen1*, Atika Melati1, Gemmy Sarina1, Akmal Djamaan1,2

Show more

1Faculty of Pharmacy, Universitas Andalas, Padang, Indonesia
2Laboratory of Sumatera Biotechnology, Universitas Andalas, Padang, Indonesia
Korespondensi : yohannesalen@yahoo.co.id (Yohannes Alen)

[collapse]

Download citation | PDF (512 kb)

Abstrak/Abstract

Kata Kunci: Aspergillus niger, in-habiting, isolasi, Macrotermes gilvus Hagen.

Pendahuluan

Di Indonesia, bahan alam yang melimpah ruah membuka peluang besar untuk eksplorasi metabolit sekunder. Metabolit sekunder mempunyai peran penting bagi penghasilnya untuk mempertahankan diri di lingkungan dalam berkompetisi dengan organisme lain1. Fenomena eksplorasi tumbuhan sebagai penghasil metabolit sekunder yang dilakukan terus menerus dapat menyebabkan terjadi ketidakseimbangan ekosistem. Oleh karena itu, perlu adanya sumber bahan alam lain yang dapat dimanfaatkan. Selain tumbuhan, metabolit sekunder juga dapat dihasilkan oleh hewan dan mikroorganisme, termasuk jamur.

Jamur yang dianggap sebagai mikroba infektif, diketahui merupakan penghasil senyawa bioaktif, seperti antibiotik, growth regulatoring, toksin, mutagenik, immunosupresan, dan efek biologi lainnya2,3. Aspergillus merupakan genus jamur dari kelas Ascomycetes dan terdiri dari sejumlah besar spesies yang dapat dieksplorasi untuk menghasilkan senyawa menarik dalam bioteknologi4. Salah satu spesies Aspergillus yang menarik untuk diteliti adalah Aspergillus niger.

Di alam, A. niger ditemukan di tanah, tempat kotor, dan tanaman yang membusuk6. Selain itu, A. niger juga hidup berdampingan dengan berbagai inang dan disebut sebagai jamur “In-Habiting”. Jamur A. niger telah diisolasi dari berbagai sumber, diantaranya dari jaringan kulit batang Garcinia griffithii dan alga laut Colpomenia sinuosa7. Penelitian oleh Alen et al., telah diisolasi jamur A. niger dari sarang ratu rayap Macrotermes gilvus Hagen8

M. gilvus Hagen. adalah rayap pembuat gundukan tanah yang tersebar di daerah Asia Tenggara, dari Malaysia dan Indo- Cina hingga Indonesia (Sumatra, Jawa, Kalimantan, dll) dan Filipina10. Rayap jenis ini memiliki habitat alami di kawasan hutan alam dengan pengaruh suhu, kelembaban, dan curah hujannya relatif stabil11.

Baru-baru ini, penelitian mengenai rayap dan sarangnya banyak menarik perhatian peneliti produk alam karena mengandung senyawa-senyawa aktif. Isolat isi perut Macrotermes mischaelseni mampu menghasilkan senyawa yang memperlihatkan aktivitas antibiotika terhadap Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan C. freundii12. Rayap hidup dan berkembang biak di dalam sarang kokoh yang dibangun oleh rayap kasta pekerja dengan cara membawa butir-butir tanah dengan mulutnya13. Kelenjar saliva dari rayap kasta pekerja ini secara otomatis berfungsi sebagai perekat sekaligus media bagi pertumbuhan jamur. Cairan liur di dalam sarang M. gilvus Hagen., adalah campuran hasil sekresi yang berasal dari kelenjar submaksilaris, sublingualis, parotis, dan kelenjar pipi (buccalis)13. Sementara itu, analisis proximate sarang ratu rayap M. gilvus Hagen. diketahui terdiri dari protein tinggi 1,39 %, lemak 1,77 %, kadar abu 87,09 %, kadar Ca 0,411 %, dan kadar P 0,147 %14,15.

Salah satu jenis rayap yang mempunyai potensi untuk diteliti ialah M. gilvus Hagen. Dari penelitian PKM-P 2014/ 2015 yang dibiayai DIKTI telah berhasil dianalisis kandungan metabolit primer, baik dari ratu maupun sarang rayap M. gilvus Hagen. Potensi ratu rayap M. gilvus Hagen. telah diteliti dan diketahui memiliki kemampuan sebagai obat luka bakar dan menghasilkan omega 9 yang dibutuhkan oleh tubuh, antihiperlipide-mia, dan immunemodulator. Lebih lanjut lagi, telah berhasil menapis empat jamur “In-Habiting” sarang ratu rayap M. gilvus Hagen., yaitu Aspergillus flavus, Mucor sp., A. niger, dan Cladosporium sp. 16,17,18,19,20.

Dari hasil analisis kromatografi lapis tipis, ditemukan pola bercak menarik dari ekstrak metanol jamur A. niger “In-Habiting” sarang ratu rayap M. gilvus Hagen., dimana terdapat berbagai metabolit sekunder dengan pola-pola bercak yang cukup terpisah. Dari perbandingan hasil kromatografi lapis tipis, ditemukan pola-pola bercak berbeda yang terdapat pada empat ekstrak metanol jamur yang bersimbiosis, sehingga diketahui bahwa kandungan metabolit sekunder yang dihasilkan berbeda. Berdasarkan penelitian tersebut, peneliti ingin mengisolasi senyawa metabolit sekunder jamur A. niger “In- Habiting” sarang ratu rayap M. gilvus Hagen14,15.

Metode

1. Alat

Magnetic stirrer (Iwaki®), rotary evaporator (Buchi®), maserator, timbangan analitik, lemari pengering (oven) (Memert®), corong pisah, kolom kromatografi, bejana Kromatografi Lapis Tipis (KLT) (chamber), plat KLT GF254 nm, lampu UV254 nm dan UV366 nm, spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu®), FT-IR (Perkin Elmer®), Melting point apparatus (Stuart Scientific®), termometer, dan peralatan laboratorium yang lazim.

2. Bahan

Isolat jamur A. niger “In-Habiting” sarang ratu rayap M. gilvus Hagen., Saboraud Dextrose Agar (SDA) (Merck, Jerman), akuades, etanol (Merck, Jerman), etil asetat (Merck, Jerman), n-heksan (Merck, Jerman), metanol (Merck, Jerman), natrium sulfat anhidrat, FeCl3, vanilin, asam sulfat pekat, pereaksi Dragendorff, silika Wakogel PF 60.

3. Prosedur

2.3.1. Pembiakan Jamur Uji
Isolat jamur A. niger dibiakkan dengan cara menggoreskan satu Ose isolat yang diambil dari  stok murni pada permukaan media SDA di dalam cawan petri, lalu diinkubasi pada suhu kamar selama tiga minggu.

2.3.2.Maserasi Jamur A. niger

Biakan jamur A. niger diekstraksi dengan cara memasukkan pelarut metanol ke dalam cawan petri, diaduk perlahan supaya medium agar tidak terbawa dan dipindahkan ke dalam maserator. Hal ini dilakukan hingga spora dan hifa jamur relatif sempurna terpisahkan. Biakan A. niger dimaserasi menggunakan pelarut metanol selama 3×5 hari. Maserat metanol diuapkan pelarutnya dengan rotary evaporator sampai kental sehingga didapatkan ekstrak kental metanol jamur.

2.3.3. Fraksinasi

Ekstrak kental metanol dari jamur A. niger dilarutkan dengan aquadest. Dilakukan fraksinasi di dalam corong pisah dengan menggunakan etil asetat dan diulang beberapa kali hingga larutan terlihat jernih. Fraksi etil asetat diuapkan pelarutnya dengan rotary evaporator sehingga didapatkan fraksi kental etil asetat.

2.3.4. Kromatografi dan Pemurnian

Fraksi kental etil asetat dilakukan pemisahan dengan kromatografi kolom. Sampel direabsorpsi dengan cara melarutkan sampel dengan sedikit etil asetat, kemudian ditambahkan silika gel hingga larutan sampel diserap oleh silika, lalu di vakum hingga terbentuk serbuk silika. Selanjutnya dilakukan kromatografi kolom menggunakan eluen n-heksan, etil asetat, dan metanol, dengan perbandingan yang selalu ditingkatkan secara bertahap (Step Gradient Polarity / SGP). Eluen ditampung dalam vial @ 5 mL, masing-masing fraksi di-KLT, spot noda yang mempunyai nilai Rf yang sama digabung. Subfraksi dimurnikan kembali menggunakan etil asetat sehingga dida-patkan pola noda tunggal sehingga diperoleh senyawa murni.

2.3.5. Identifikasi dan Karakterisasi Senyawa Hasil Isolasi

Identifikasi dan karakterisasi senyawa hasil isolasi meliputi pemeriksaan fisika, kimia, dan fisikokimia. Pemeriksaan fisika meliputi pemeriksaan organoleptis, pemeriksaan kelarutan, dan penentuan jarak leleh menggunakan melting point apparatus. Pemeriksaan kimia meliputi penentuan golongan senyawa, pemeriksaan KLT, dan peme-riksaan kemurnian dengan penampak noda lampu UV 250 nm dan UV 365 nm. Sementara itu, pemeriksaan sifat fisikokimia meliputi penentuan panjang gelombang maksimum melalui pengukuran spektrum ultraviolet dan penentuan gugus fungsi melalui spektrum inframerah.

Hasil

Hasil kultivasi jamur A. niger dapat dilihat pada Gambar 1. Terhadap senyawa murni hasil isolasi dilakukan karakterisasi dengan pemerikssaan fisika, kimia, KLT dan spekrofotometri UV-Vis dan IR. Hasil pemeriksaan fisika, kimia, dan KLT senyawa murni hasil isolasi dapat dilihat pada Tabel 1. Pemeriksaan spektrum UV-Vis dan spektrum IR ditunjukkan pada Gambar 2, 3, 4, dan 5.

 

Pembahasan

Pemeriksaan pendahuluan potensi ekstrak jamur A. niger “In-Habiting” sarang ratu rayap M. gilvus Hagen. dilakukan terhadap beberapa mikroba uji. Dari penelitian tersebut, didapatkan ekstrak metanol yang aktif menghambat bakteri patogen Staphylococcus aureus ATCC 25923 pada konsentrasi 10.000 ppm23. Berdasarkan hasil penelitian tersebut, selanjutnya dilakukan isolasi metabolit sekunder dari ekstrak metanol jamur A. niger “In-Habiting” sarang ratu rayap M. gilvus Hagen.

Sampel jamur dikoleksi dari perkebunan kelapa sawit Silaut, Pesisir Selatan, Sumatera Barat. Proses isolasi senyawa murni dimulai dengan pembuatan starter kultur untuk kultivasi jamur di dalam media padat yaitu SDA, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 3 minggu. Pembuatan starter kultur ini bertujuan untuk memperoleh spora yang masih muda untuk menghasilkan senyawa metabolit yang lebih baik, sehingga pada tahap ini diharapkan memperoleh jamur dengan metabolit yang aktif21. Dari proses pembiakan jamur, koloni jamur A. niger menunjukkan adanya hifa berwarna abu-abu dan spora berwarna hitam (Gambar 1). Selanjutnya proses kultivasi 168 petri A. niger dihasilkan jamur sebanyak 468,72 g.

Setelah dilakukan ekstraksi jamur dari media pertumbuhan SDA, selanjutnya dilakukan ekstraksi senyawa metabolit sekunder dengan cara maserasi menggunakan pelarut metanol. Pemilihan metode maserasi dalam ekstraksi ini dikarenakan teknik pengerjaan dan alat-alat yang digunakan lebih sederhana serta dapat digunakan untuk mengekstraksi senyawa termolabil22. Dari proses ekstraksi, diperoleh ekstrak kental metanol sebanyak 20,2943 g (rendemen ekstrak 4,32% dari berat sampel).

Selanjutnya ekstrak kental tersebut dilakukan pemeriksaan kromatografi lapis tipis (KLT) untuk melihat pemisahan bercak dan tingkatan kepolaran senyawa metabolit sekunder yang terkandung didalamnya. Hasil KLT ekstrak metanol menggunakan eluen etil asetat : metanol (9:1) dan pendeteksian bercak di bawah sinar UV254nm, menunjukkan bahwa terdapat bercak atau spot pada ukuran Rf 0,52; 0,68; 0,78; dan 0,84; serta kelompok senyawa yang masih belum terpisah sempurna pada ukuran Rf 0-0,16. Berdasarkan pemeriksaan tersebut, terlihat empat bercak atau spot yang cukup terpisah yang selanjutnya senyawa akan dilanjutkan untuk proses fraksinasi.

Ekstrak kental metanol difraksinasi dengan etil asetat menggunakan corong pisah. Berdasarkan hasil fraksinasi, didapatkan fraksi etil asetat sebanyak 2,92 g (rendemen fraksi 14,39% dari berat ekstrak). Dari hasil pengamatan penyebaran noda dengan metode kromatografi lapis tipis, fraksi etil asetat memperlihatkan pemisahan noda yang sederhana dan jelas dengan menggunakan eluen n-heksana : etil asetat (6:4), yang selanjutnya digunakan sebagai eluen untuk proses pemisahan senyawa. Proses pemisahan dilakukan menggunakan fase gerak n-heksana dan etil asetat dengan perbandingan yang selalu ditingkatkan secara bertahap atau Step Gradient Polarity (SGP).

Dari proses isolasi senyawa metabolit sekunder dari A. niger “In-Habiting” sarang ratu rayap M. gilvus Hagen., diperoleh dua senyawa murni, yaitu senyawa dengan notasi AM-12-22-01 dengan berat 35 mg (rendemen 1,19 % dari fraksi etil asetat) dan AM-12- 60-01 seberat 15 mg (rendemen 0,51 % dari fraksi etil asetat). Senyawa AM-12-22-01 memberikan Rf 0,45 dengan eluen n-heksan : etil asetat (8:2), sedangkan senyawa AM-12- 60-01 memberikan nilai Rf 0,45 dengan eluen n-heksan : etil asetat (7:3).

Pemeriksaan fisika senyawa hasil isolasi terdiri dari pemeriksaan organoleptis, kelarutan, dan jarak leleh. Secara organoleptis, senyawa AM-12-22-01 berbentuk kristal jarum, berwarna putih, dan tidak berbau dengan jarak leleh 151-153oC. Senyawa ini mudah larut dalam etil asetat dan kloroform, sukar larut dalam n-heksan dan metanol. Sementara itu, senyawa AM-12-60-01 berbentuk kristal jarum, berwarna putih, dan tidak berbau dengan jarak leleh 91-93oC. Senyawa ini mudah larut dalam etil asetat dan kloroform, sukar larut dalam metanol dan sukar larut dalam n-heksan. Kedua senyawa ini relatif murni karena menunjukkan jarak leleh yang sempit.

Pemeriksaan kimia yang dilakukan menggunakan penampak noda. Dari hasil pemeriksaan, senyawa AM-12-22-01 dan AM-12-60-01 menghasilkan warna biru kehitaman setelah direaksikan dengan FeCl3. Berdasarkan hal tersebut, kedua senyawa hasil isolasi ini merupakan termasuk golongan fenolik. Kemurnian senyawa ditegaskan dengan Multiple Developing System, yang tetap menunjukkan pola KLT satu noda setelah dilakukan KLT berulang pada satu plat tersebut.

Dari hasil analisis data spektrofotometer Ultraviolet-visible (UV-Vis) senyawa AM- 12-22-01 memperlihatkan adanya serapan pada panjang gelombang 292,80 nm (Abs: 0,153); 261,60 nm (Abs: 0,256); 270,60 nm (Abs: 0,277); 261,00 nm (Abs: 0,264); 250,80 nm (Abs: 0,249); dan 202,20 (Abs: 0,788), hasil ditunjukkan pada Gambar 2. Sedangkan, untuk senyawa AM-12-60- 01 pada panjang gelombang 306,40 nm (Abs: 0,013); 283,00 nm (Abs: 0,053); dan 203,80 nm (Abs: 0,729), hasil ditunjukkan pada Gambar 3. Berdasarkan spektrum UV-VIS kedua senyawa menunjukkan adanya transisi dari π ke π* dari ikatan rangkap terkonjugasi yang lazimnya adalah cincin aromatis, karena sistem konjugasi menyerap cahaya pada panjang gelombang 200-400 nm dan kenaikan intensitas yang besar. Adanya sistem aromatis ini didukung oleh hasil analisis spektrofotometer IR dimana hasil analisis data spektrofotometer IR senyawa AM-12-22-01 menunjukkan adanya gugus hidroksi (OH) diindikasikan dengan pita serapan pada bilangan gelombang 3402,89; serapan pada bilangan gelombang 2939,12 dan 2873,83 menunjukkan adanya gugus metilen (regang –C-H); 1730,85 (regang C=O); 1451,81 (regang cincin C=C) dan 832,63 (C-H bending) cm-1 (Gambar 4), serta senyawa AM-12-60-01 pada bilangan gelombang 3298,98 (regang O-H); 2944,05 (regang –C-H); 1892,81 dan 1716,16 (regang C=O); 1535,93 dan 1452,92 (regang cincin C=C); dan 771, 46 (C-H bending) cm-1 (ditunjukkan pada Gambar 5).

Dari hasil penelusuran literatur, belum ditemukan adanya senyawa yang memiliki karakteristik yang sama dengan menggunakan pelarut yang sama dengan kedua senyawa tersebut. Hal ini membutuhkan penelitian selanjutnya untuk melihat elusidasi kimia kedua senyawa tersebut.

Simpulan

Penelitian dapat disimpulkan bahwa diperoleh dua senyawa metabolit sekunder A. niger simbiotik sarang ratu M. gilvus Hagen., yaitu senyawa AM-12-22-01 seberat 35 mg (rendemen 1,19 % dari fraksi etil asetat) dan AM-12-60-01 seberat 15 mg (rendemen 0,51 % dari fraksi etil asetat). Selanjutnya dari data pemeriksaan golongan kimia utama, senyawa AM-12-22-01 dan AM-12-60-01 diduga merupakan golongan fenolik.

Ucapan Terima Kasih

Artikel ini merupakan bagian dari penelitian skripsi sarjana farmasi di Fakultas Farmasi Universitas Andalas yang telah dipresentasikan dalam Seminar Nasional dan Workshop Perkembangan Terkini Sains dan Farmasi Klinik 6. Penelitian ini dibiayai oleh Kementerian Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi (Kemenristekdikti) dalam bentuk dana hibah penelitian Program Kreatifitas Mahasiswa bidang Penelitian (PKM-P). Penulis mengucapkan terima kasih pada semua pihak yang turut membantu, mendukung, memberikan kritik dan saran yang membangun, bimbingan dan arahan.

Daftar Pustaka

  1. Fox EM, Howlett BJ. Secondary metabolism: regulation and role in fungal biology. Curr opin microbiol. 2008;11(6):481-7.
  2. Keller NP, Turner G, Bennett JW. Fungal secondary metabolism—from biochemistry to genomics. Nat Rev Microbiol. 2005;3(12):937-47.
  3. Pelaez FE. Biological activities of fungal metabolites. Handbook of industrial mycology. New York: Marcel dekker; 2004 Aug 30:49-92.
  4. Yager LN, Bennet J, Klich MA. Aspergillus: biology and industrial applications. Aspergillus biology and industrial applications. 1992.
  5. Samson, R.A., Hoekstra, E.S., & Oorschot, C.A.N. Introduction to food borne fungi. Netherland: Centra albureau for schimmcl cultures; 1996.
  6. Schuster E, Dunn-Coleman N, Frisvad JC, Van Dijck P. On the safety of A. niger–a review. Appl microbiol biotechnol 2002;59(4-5):426-35.
  7. Elfita E, Muharni M, Munawar M, Aryani S. Secondary Metabolite from Endophytic Fungi A. niger of The Stem Bark of Kandis Gajah (Garcinia Griffithii). Indones J Chem. 2012;12(2):195-200.
  8. Zhang Y, Li XM, Wang BG. Nigerasperones A~ C, New Monomeric and Dimeric Naphtho-γ-pyrones from a Marine Alga-derived Endophytic Fungus A. niger EN-13. Journal antibiot. 2007;60(3):204-10.
  9. Alen, Y., Sari, M.P., & Putra, D.P. Penapisan jamur dari sarang anai-anai (M. gilvus Hagen.) dan uji aktivitas anti-jamur. Abstrak paper dan prosiding seminar nasional dan workshop perkembangan terkini sains farmasi dan klinik V. Padang; 6-7 November 2015a.
  10. Roonwal ML, Chhotani OB. The termite M. gilvus malayanus (Haviland) (Termitidae) in Burma. InProc Nat Inst Sci India 1961 (Vol. 27, No. 308, p. e16).
  11. Subekti, Niken., D. Duryadi, D. Nandika, S. Surjokusumo, dan S. Anwar. Distribution and Morphology Characteristic of M. gilvus Hagen. in The Natural Habitat. Jurnal Ilmu Dan Teknologihasil Hutan. 2008; 1(1): 27-33.
  12. Ayitso AS, Onyango DM, Wagai SO. Antimicrobial Activities of Microorganisms Obtained from the gut of Macrotermes michaelseni in Maseno, Kenya. Journal of Applied Biology and Biotechnology Vol. 2015;3(06):048-52.
  13. Lommelen E, Schoeters E, Billen J. Ultrastructure of the labial gland in the ant Pachycondyla obscuricornis (Hymenoptera, Formicidae). Netherlands journal of zoology. 2002;52(1):61-8.
  14. Alen, Y., Okta, F.N., Rusdian, R., Agresa, F.L., Marcelina, S., & Fitri, A.M. Analisis metabolit primer sarang ratu anai-anai M. gilvus Hagen. dari kebun sawit muko-muko bengkulu. Abstrak paper dan prosiding seminar nasional dan workshop perkembangan terkini sains farmasi dan klinik V; 6-7 November 2015b; Padang, Indonesia. Indonesia: Padang; 2015.
  15. Alen Y, Lakmi NS, Orindia S, Harrizul R. Analysis of amino acids levels of freeze-dried termite queen M. gilvus Hagen., Int J Ind Herbs Drugs, 2017; 2; 1-5.
  16. Alen Y, Lakmi NS, Orindia S, Agus S, Ayu L, Fuji Y, Febriyenti. Isolasi (Penetapan Kadar) Metabolit Primer Ratu Rayap (M. gilvus Hagen.) dan Potensi Sebagai Obat Luka Bakar. Abstrak paper dan prosiding seminar nasional dan workshop perkembangan terkini sains farmasi dan klinik V; 6-7 November 2015b; Padang, Indonesia. Indonesia: Padang; 2015.
  17. Alen, Y., Suci, L.N., Suarmin, O., Suhatri, Larassati, A., Suparman, A., & Yeni, Y.F. Primary metabolites analysis of termite queen (M. gilvus Hagen.) and burn healing assay. Paper abstract the international conference on advancing the life sciences and public health awareness. Nagoya, Jepang. 10-11 Juli 2016a.
  18. Alen Y, Orindia S, Lakmi NS, Harrizul R. Analysis of Fatty Acids levels of Freeze-dried termite queen M. gilvus Hagen using gas chromatography-mass spectrometry. International Journal of Indigenous Herbs and Drugs. 2017; 2(4): 1-4.
  19. Alen, Y., Suarmin, O., Suci, L.N., Kurniawan, R., Yasardi, F., & Ramadhani, V. Analysis levels of fatty acids from freeze-dried termite queen M. gilvus Hagen., using gc-ms and anti-hyperlipidemia test. Paper abstract the international conference on advancing the life sciences and public health awareness. Nagoya, Jepang. 10-11 Juli 2016b.
  20. Alen, Y., Rahmawati, R., Aldi, Y., Nitoda, T., Baba, N., & Nakajima, S. Immunomodulatory activity of freeze dried termite queen M. gilvus Hagen. Paper abstract the international conference on advancing the life sciences and public health awareness. Nagoya, Jepang. 10-11 Juli 2016c.
  21. Pengaruh Penambahan Biotin Pada Media Pertumbuhan Terhadap Produksi Sel A. niger. Bioma. 2008; 10(2): 46-50
  22. Bassets, J., R.C. Denny, G.H. Jeffrey, dan J. Mendham. Buku Ajar Vogel : Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Terjemahan oleh A. Hadyana P. dan Ir. L. Setiono. Jakarta: EGC; 1994.
  23. Alen, Y., M.P. Sari, dan D.P. Putra. Penapisan Jamur dari Sarang Anai-Anai (Macrotermes gilvus Hagen.) dan Uji Aktivitas Anti-Jamur. Abstrak paper dan prosiding seminar nasional dan workshop perkembangan terkini sains farmasi dan klinik V; 6-7 November 2015b; Padang, Indonesia. Indonesia: Padang; 2015.
  24. Analisis struktur senyawa organik secara spektrofotometri. Padang: Andalas university press; 2004.